高效液相色谱分离中缓冲液使用指南

缓冲区起着重要的作用在反相高效液相色谱分离。pH值的变化影响样品分子的电离度。

在非极性分子中，这种变化很小，但在酸性或碱性极性分子中，这种变化就显着了。

改变pH值可以有效地分离间隔较近的洗脱峰，甚至可能导致分离峰的合并。正是由于这个原因，通过使用缓冲液控制pH值有助于改善紧密间隔或重叠峰的分离。

有几个关键因素，有助于控制pH通过使用缓冲液，这篇文章中简要介绍。

缓冲选择

选择合适的缓冲液是由缓冲液的特性决定的，如pka,pH值范围和紫外截止。这些参数的值可以很容易地在参考文本中找到。

作为一般规则，pH缓冲液应该在其pka值的+/- 1单位内使用。在这个范围内，缓冲液可以抵抗任何刻意改变pH值的企图。例如，pka值为4.8的缓冲液可以在pH值为3.8-5.8的范围内有效使用。还应考虑紫外截止值，因为检测波长不应干扰缓冲吸光度。

缓冲pH值

硅基色谱柱不应使用在pH值范围2.0-8-0之外。当pH值低于2.0时，有机键合相会出现损失，当pH值高于8.00时，固定相硅基主链的溶解度会提高。对于这样的应用程序列与其他包装可以被证明是有用的。

缓冲液浓度

确定缓冲液浓度对方法开发很重要。理想情况下，应选择可重复结果的最低浓度。浓度越高，极性分子的洗脱速度越快。一般缓冲液浓度不应低于0.005M。

低于这个浓度，它就不能继续作为有效的缓冲液。随着缓冲液浓度的增加，缓冲液的粘度增加，从而使柱背压增加。正常情况下浓度应保持在0.005 ~ 0.1M范围内。

缓冲溶解度

缓冲液应完全溶解在溶解介质中。在较高的浓度下，当与流动相的有机组分接触时，就会发生沉淀。这种沉淀会导致泵的运行问题以及塔的堵塞。

缓冲溶液的制备

在量瓶中称量所需的量，并开始加入所需的溶剂。在装入烧瓶之前，调整溶液的pH值到要求的刻度。在开始加入所需的有机相之前，应调整pH值。然后通过0.45μm过滤器过滤溶液用于常规分析应用和0.22μm过滤器用于UHPLC应用程序。

这对于去除任何残留的固体悬浮液是必要的。缓冲液制备后应尽早使用，如果在使用前观察到任何固体或细菌悬浮液，应丢弃，新鲜制备。

可以看出，缓冲在大多数情况下起着至关重要的作用高效液相色谱法分离。方法开发通常需要仔细选择缓冲液，并在其准备过程中充分注意。