光学显微镜如何解决一个常见的实验室问题
研究人员经常在显微镜下研究生物分子(尤其是蛋白质)的行为，希望能确定一种特定蛋白质的功能。为了更容易地追踪蛋白质，研究人员经常添加分子标签。与传统的纸质标签不同，大多数人想象分子标签是利用染料或共价键将荧光、放射性或报告酶分子附着在目标蛋白质上。
理解标记成像的利弊可以揭示为什么像显微镜这样的方法是优秀的蛋白质的特性跟踪活细胞内蛋白质的运动。
标记成像的缺点
虽然这些标记使研究人员更容易跟踪目标蛋白，但也有缺点。一些染料和荧光剂干扰正常的细胞功能，这可能使蛋白质行为的研究变得无关紧要。另一些则提供太多的荧光，使其难以区分蛋白质和其他细胞部分，甚至可能受到周围光线的光漂白。
因此，研究人员开发出了研究组织结构、蛋白质行为和其他现象的方法，而不需要在实验室样本中添加荧光标签或染料。这些无标记成像技术消除了更多的侵入性标记对样品本身以及对产生的成像的负面影响。这些技术主要依靠光学显微镜的使用。
光学显微镜
利用光学显微镜来研究细胞和蛋白质的行为并不是什么新鲜事。然而，用于产生所研究材料图像的激光技术的进步使得所提供图像的质量急剧提高。此外，成像是无创的，对所研究的细胞材料产生的影响很小。
首先，这些成就需要使用双光子激发荧光显微镜，这是一种使用精确的、超快的激光来提供蛋白质或其他细胞部分之间的对比的技术。这种激光器通常工作在红外水平，脉冲两个或更多的光子非常快地激发荧光团化合物。作为回应，这些化合物释放出光子，发出可见光谱上的光。
选择正确的技术
与任何发光过程一样，散射——周围其他化合物产生的光的再吸收和再发光——是必然发生的。一些无标记的方法，如光学相干层析成像，利用这种散点重建由散点模式产生的图像。其他方法，如二次谐波显微镜(宋惠乔)和三次谐波显微镜(THG)，涉及非线性光散射过程，而红外显微镜导致分子中的化学键振动。
另一项令人兴奋的技术是干涉散射显微镜，它的工作原理是将散射光与参考光场一起收集。研究人员利用激光提供的参考，测量光散射引起的干涉，允许成像小至50千道尔顿的蛋白质。
根据研究目标，一种技术可能比另一种更可取。例如,THG它的用途相当广泛，但不能广泛用于活体样品，因为它的电离辐射会对细胞造成不可逆的损伤。对于实验室来说，为手头的工作选择正确的波长也是很重要的，因为某些波长的光损伤最小，是延时成像的最佳选择。
持续的进步
许多实验室结合使用两种、三种或更多的技术，这取决于他们想要达到的结果。随着光学显微镜领域的研究和发展的继续，科学家们希望改进多模态技术，使实验室可以选择利用每项技术的所有最好方面，同时，不受彼此的干扰。这些努力的持续进展可能会导致一种微创、无干扰、无标签的方法，从一个给定的样本中获得尽可能多的信息。
来源:
https://www.nature.com/articles/s41592-019-0664-8
https://en.wikipedia.org/wiki/Interferometric_scattering_microscopy
https://www.toptica.com/applications/optical-microscopy/multiphoton-microscopy/
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